利用荧光染料填充纳米小孔阵列，科学家们研发出一种校正超高倍显微镜的新型方法，推动光学显微镜技术革新，实现了对单分子高精度的追踪。 

一种校正高倍显微镜的创新性方法使得在纳米尺度对单分子的三维运动进行追踪成为了可能。 

在W. E. Moerner的带领下，一些来自斯坦福大学的研究人员开展了这项研究，并且因此和他的同事Eric Betzig和Stefan W. Hell Moerner获得了2014年度的诺贝尔化学奖。Eric和Moerner首创性地推动了超分辨率成像技术的发展，他们利用单分子的荧光性突破了由于光学显微镜衍射产生的限制。这项新的研究发表于在光学领域很有影响力的Optica杂志上，它展示了这种荧光成像技术和三维空间追踪分子在准确度方面的显著提高。 

追踪分子的运动、成形以及其与身体细胞和神经元的相互作用过程能够为一些重要的生理过程（如细胞间的信号传递、细胞分裂和神经元交流）提供一种新的视角，这些生理过程影响着人们的健康和对疾病的抵抗力。 

光学显微镜技术革新 

超分辨率的显微镜使用激光激发单分子，在同一时刻只有少数分子出现荧光，这样就可以克服传统光学显微镜由于衍射极限而导致分辨率低的缺点。 

“随着超分辨率成像的出现，我们突破了衍射极限，将分辨率提高了5到10倍——从200nm到40甚至10nm，”Moerner说：“分辨率的大幅提升使光学成像系统发生了巨大的转变。” 

然而先前校准超分辨率显微镜的技术对于单分子的三维测量还不够精确。新的校准方法使用纳米孔道阵列来校正显微镜视场中的光学失真。 

解决图像失真问题 

单分子尺度成像时，来自一个分子的点光源通常可以准确定位到10nm的精度。在如此高的分辨率下，在光学系统中任何小的缺陷都将导致图像失真或相差,从而使测量发生显著的偏差，尤其是当进行三维测量时。由此产生的误差可能意味着对两个分子之间关系的理解出现偏差，例如无法分辨两分子是相互作用还是简单地相互靠近。 

当许多研究者使用荧光粉校准3D显微镜时，斯坦福大学Moerner实验室的Alex von Diezmann博士却采取了不同的方法：他在金属薄膜上排列了许多小孔来组成阵列，每一个孔径都小于200nm，并且小孔之间间隔2.5μm，以此作为3D校准的标准。一旦小孔内充满了荧光染料，该阵列可用来校准显微镜整个视场中的光学紊乱而不仅是几个特定的点。使用这种技术，研究人员能够将相差从50~100nm降至25nm。 

“在此之前，没有人明确地考虑过这些相差可能造成的影响，” von Diezmann说：“而我们的工作证明了场依赖性相差的存在，并且表明它们确实会降低图像的清晰度，这正是这项工作的重要性之一。” 

研究人员利用双螺旋和象散点扩散函数（通常用来提取Z轴坐标的两种光学修正）研究了新的校准技术。尽管3D测量中点扩散函数在z轴相关的精度方面存在约20%的误差，但是研究者使用3 D纳米孔道阵列可以校正这些误差。 

在细菌内蛋白质的研究中显示出优势

 研究人员目前正在将新的校正技术应用于所有单分子追踪和超分辨率显微的研究中。例如，von Diezmann用它来研究长度仅有2μm的细菌中蛋白质的定位，通过3 D校正技术，他可以在纳米尺度精确测量和追踪尺寸仅150~200nm的关键信号蛋白。 

研究人员指出，随着光学显微镜技术逐渐应用于细胞内成像，纠正场依赖型和其他类型的相差就变得愈发重要。von Diezmann举例说：“我们针对这种使用情况进行了一些研究，发现它适用于校正各种需要高精度3 D测量的超分辨率或定位显微镜的使用。如果哪个研究组用它来弄清楚场依赖型相差究竟是如何影响他们的技术时，这将是很有意义的，也许我们可以共同找到处理这些相差的更好办法。” 

研究者们利用充满荧光染料纳米孔道阵列制造出了一种3D校准工具。在图(a)中，视场的光(绿色)穿过玻璃盖玻片到达在铝层表面刻蚀形成的纳米孔道上。荧光染料溶液充满小孔，此产生的光点(橙色)可被检测到。如图(b)所示，小孔的扫描电镜图像中孔径为200nm或更小